Determinação de novo das estruturas mosquitocidas Cry11Aa e Cry11Ba naturalmente

Nature Communications volume 13, número do artigo: 4376 (2022) Citar este artigo

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Cry11Aa e Cry11Ba são as duas toxinas mais potentes produzidas pelo mosquitocida Bacillus thuringiensis subsp. israelensis e jegathesan, respectivamente. As toxinas cristalizam naturalmente no hospedeiro; no entanto, os cristais são demasiado pequenos para determinação da estrutura em fontes síncrotron. Portanto, aplicamos cristalografia serial de femtossegundos em lasers de elétrons livres de raios X a nanocristais dessas toxinas cultivados in vivo. A estrutura do Cry11Aa foi determinada de novo usando o método de dispersão anômala de comprimento de onda único, que por sua vez permitiu a determinação da estrutura do Cry11Ba por substituição molecular. As duas estruturas revelam um novo padrão para cristalização in vivo de toxinas Cry, em que cada um dos seus três domínios contém um domínio simetricamente idêntico, e um motivo de empacotamento de cristal clivável está localizado dentro da protoxina e não nos terminais. A diversidade de padrões de cristalização in vivo sugere explicações para os seus variados níveis de toxicidade e abordagens racionais para melhorar estas toxinas para o controle do mosquito.

Os inseticidas biológicos mais comumente usados ​​para controlar populações de mosquitos e vetores de mosca negra são produzidos pela bactéria Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti), descoberto em Israel em 19761. Esses produtos têm como alvo o estágio larval de uma ampla variedade de vetores e, devido à sua alta eficácia e segurança ambiental, substituíram os inseticidas químicos sintéticos de amplo espectro em muitos programas de controle de vetores. Estes incluem Anopheles gambiae e espécies relacionadas que transmitem a malária, bem como numerosas espécies de Culex e Aedes que espalham vírus como os que causam a encefalite do Nilo Ocidental e a febre amarela. Os produtos Bti também são usados ​​em África para regular as espécies de mosca negra responsáveis ​​pela vectorização dos vermes filariais que causam a oncocercose. Além das populações de vetores, eles são usados ​​para controlar mosquitos incômodos no Vale do Reno, na Alemanha, na Camargue, no sul da França, e em todos os EUA, Ásia e América Latina e do Sul, com milhares de toneladas aplicadas nos últimos 30 anos.

A atividade mosquitocida altamente potente do Bti é devida a três formas nanocristalinas de quatro protoxinas, viz. Cyt1Aa, Cry11Aa e Cry4Aa e Cry4Ba co-cristalizados. Estes são produzidos durante a esporulação e são notavelmente estáveis ​​em uma variedade de condições, mas se dissolvem após a ingestão sob os altos níveis de pH alcalino característicos do intestino médio do mosquito larval2. As protoxinas solubilizadas são ativadas por proteases intestinais de insetos, permitindo a ligação às membranas celulares intestinais, subsequente oligomerização e, finalmente, lise celular intestinal, levando à morte larval2. As toxinas Bti são ambientalmente seguras porque são muito mais específicas para os mosquitos-alvo do que os larvicidas químicos de amplo espectro.

A mais potente das quatro toxinas Bti é a Cry11Aa, mas a sua ativação e mecanismo de toxicidade são pouco compreendidos, em grande parte porque, ao contrário de Cry4Aa, Cry4Ba e Cyt1Aa, a sua estrutura é desconhecida. Uma toxina relacionada produzida por Bt subsp. jegathesan (Btj) é Cry11Ba, que é sete a trinta e sete vezes mais tóxico que Cry11Aa contra as principais espécies de mosquitos vetores pertencentes aos gêneros Aedes, Anopheles e Culex3, e em alguns hospedeiros bacterianos parece formar cristais ligeiramente maiores. A estrutura do Cry11Ba também é desconhecida, embora tenha sido usada como substituto do Cry11Aa em cepas recombinantes de Bti para melhorar significativamente a atividade mosquitocida . Assim, nosso objetivo foi determinar as estruturas das protoxinas Cry11Aa e Cry11Ba para ajudar a entender como elas conseguem a formação de cristais robustos lábeis apenas em pH alcalino, e obter insights estruturais para aumentar a eficácia dessas proteínas no controle de mosquitos.

A determinação da estrutura das protoxinas Cry11Aa e Cry11Ba a partir de nanocristais naturais requer tecnologia de ponta. A cristalografia convencional é limitada a projetos nos quais os cristais são suficientemente grandes para montar e oscilar individualmente em um feixe de raios X síncrotron. No passado, os cristais de Cry4Aa5, Cry4Ba6 e Cyt1Aa7 ativados atingiram tamanho suficiente cultivando-os in vitro a partir de toxinas dissolvidas de nanocristais naturais e ativando as toxinas enzimaticamente. No entanto, Cry11Aa e Cry11Ba não recristalizam in vitro a partir de nanocristais dissolvidos8. Além disso, a ativação enzimática é indesejada, uma vez que nosso objetivo é compreender o mecanismo de dissolução natural do cristal controlado pelo pH. Para observar o estado da protoxina em nanocristais naturais produzidos em células bacterianas, aplicamos cristalografia serial de femtossegundos (SFX) em lasers de elétrons livres de raios X (XFEL) . No experimento SFX, pulsos de feixe XFEL de alto brilho, cada um durando apenas ~10–50 fs, interceptam uma série de nanocristais, um pulso por cristal, provocando o sinal de difração mais forte possível de cada cristal minúsculo antes de vaporizar, e produzindo um série de instantâneos de difração, posteriormente montados em um conjunto completo de dados. A viabilidade desta estratégia foi demonstrada pela recente elucidação da cascata completa de bioativação do Cyt1Aa12.